如何选择合适的二抗？

二抗用于多种免疫测定中，以检测一抗的存在。这些抗体与酶、生物分子或荧光染料偶联，以便检测一抗。与一抗不同，二抗针对一抗的物种和同种型产生，并通过在多个位点与一抗结合来检测一抗。

要成功选择二抗，应考虑以下因素：

确保良好匹配 – 宿主物种是产生二抗的动物，应始终与一抗的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中产生的一抗，您将需要在兔子以外的其他物种（如山羊、驴或小鼠）中产生的抗兔二抗（图 1）。

图 1：二抗机制。

完整的抗体还是片段？ – 实际上，真正的问题是“您的一抗是单克隆还是多克隆？这两个问题的答案通常取决于应用程序。单克隆一抗包含免疫球蛋白的单一同种型。因此，使用特异性识别该同种型的二抗至关重要。此外，单克隆抗体通常在小鼠、兔子和大鼠中产生。因此，如果一抗是小鼠 IgG1，您将需要抗小鼠 IgG 或特异性较低的 F（ab） 片段抗小鼠 IgG。抗体片段适合免疫组化和免疫荧光，因为它们体积较小且能够穿透组织。然而，较小的尺寸可能会限制与片段偶联的染料或酶的选择，从而导致二抗的灵敏度可能不如全抗体选择。

多克隆一抗包含免疫球蛋白 G 的几种同种型的混合物。因此，为了最大限度地检测靶标，最好使用可识别所有同种型的二抗。多克隆抗体通常在兔、山羊、绵羊和驴中以全抗体形式（重链 + 轻链）饲养，因此必须用来自不同物种的 IgG 库对二级宿主物种进行免疫，从而使纯化的二抗能够识别所有形式。例如，如果一抗多克隆抗体是山羊 IgG，则需要抗山羊 IgG （H+L）。然而，全抗体会导致高背景和低特异性，因为轻链由所有免疫球蛋白共享，这会增加交叉反应性（图 2）。

图 2：免疫测定中全 IgG 二抗与片段化二抗的结合机制。

根据您的应用选择偶联物 - 这取决于二抗如何检测信号。例如，免疫组织化学、ELISA 和蛋白质印迹应用使用基于生物素标记的比色和化学发光检测来放大信号并提高灵敏度，以及与辣根过氧化物酶 （HRP） 或碱性磷酸酶 （AP） 起作用的酶促反应。然而，对于免疫标记、荧光显微镜和流式细胞术实验，使用荧光染料（如 Alexa Fluor）检测信号，这些染料直接与抗体偶联以放大信号和灵敏度。

亲和纯化抗体与交叉吸附抗体 – 此步骤用于提高抗体的特异性，并且可以在亲和纯化和交叉吸附方面进行区分。大多数二抗通过亲和层析进行纯化，从而产生高亲和力抗体。这种抗体通常用于 IHC，因为它们提供最小的非特异性结合，也可用于 western blot 以检测低丰度蛋白质。交叉吸附的二抗通常会经过额外的纯化步骤，以过滤掉与脱靶免疫球蛋白种类结合的成员。此步骤增加了它们的特异性并降低了非特异性背景。这些抗体专为免疫组织化学等特定应用而设计。