实体组织样本使用Caprico Biotechnologies流式细胞抗体注意点

　　荧光素的搭配，是多色体系搭建的第一步，要兼顾抗原表达丰度与荧光亮度。细胞表面标志物表达水平各有不同，部分标志物属于高丰度表达，部分属于低丰度表达。低丰度的靶标，如果搭配亮度偏弱的荧光素，阳性群体信号容易淹没在背景噪声之中；高丰度靶标搭配过强荧光，又容易出现信号溢出，干扰相邻通道。在设计之初，可以把低表达靶标分配亮度更高的荧光素，高表达靶标分配中等亮度荧光素。同时要留意串联型荧光染料，这类染料对于固定、光照较为敏感，如果实验流程包含后续固定步骤，就要评估这类染料是否适配整套流程，避免染色之后信号出现衰减。

　　表位特性与实验处理流程之间的匹配，很容易被忽略。部分抗体识别的是细胞膜外侧天然构象表位，适合活细胞染色；当实验需要做胞内或者核内染色，会经过固定、通透步骤，蛋白空间构象会发生改变，只识别天然构象的抗体就无法结合靶标，得不到有效信号。同一个靶标，不同克隆识别的表位不一样，活细胞染色效果良好，不代表可以直接用于胞内染色。搭建panel时，需要区分本次实验是活细胞表面染色，还是需要破膜处理的胞内检测，确认对应抗体适配的实验处理条件，不要直接照搬文献当中的panel组合，文献的样本处理流程未必和自身实验一致。

　　不同样本来源，同样会影响染色效果，外周血分离单细胞、实体组织消化制备单细胞悬液、体外培养细胞，三类样本的细胞状态有差异。实体组织经过酶消化，部分细胞膜表面蛋白会被酶降解，对应的抗原表位丢失，抗体无法结合，出现假阴性结果。使用组织来源单细胞悬液开展实验，需要评估消化酶种类、消化时长会不会破坏待检测靶标。如果文献缺少相关参考，可设置对照，使用未经过消化处理的同源细胞，对比染色信号，以此判断消化流程是否对靶标带来破坏。

　　多色实验当中荧光补偿是关键环节，补偿设置不合理，通道之间荧光溢漏会干扰分群。很多研究人员直接使用仪器预设补偿，没有结合本次panel开展对应补偿管设置，不同荧光组合，溢漏情况存在差异，预设补偿不能适配所有panel。每一套全新的多色组合，都要准备单染补偿管，每一支补偿管仅标记单一荧光，以此完成补偿计算。样本数量较多的批次实验，细胞活力会随时间下降，死细胞会出现非特异性染色，抬升整体背景，建议加入活死细胞染料，在数据分析阶段把死细胞群体排除，减少死细胞带来的干扰。

　　多色流式panel不是简单把多款抗体混合，荧光分配、表位适配、样本处理、补偿设置共同决定实验质量。Caprico Biotechnologies流式细胞抗体为免疫表型分析提供可选材料，完整的预实验验证，才可以保障细胞分群清晰，实验结果具备可重复性。