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γ谷氨酰转肽酶(γGT)测定(比色法)测试盒

简要描述:γ谷氨酰转肽酶(γGT)测定(比色法)测试盒: 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-06
  • 访  问  量:74

详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

γ谷氨酰转肽酶(γGT)测定(比色法)测试盒


注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。

测定原理:

γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通过测定405nm光吸收增加速率,来计算γ-GT酶活性。

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体4mL×1瓶,4℃保存。

试剂四:液体14.8mL×1瓶,4℃保存。

工作液(在试剂二瓶中配制):临用前配制,把试剂三倒入试剂二瓶中,充分溶解(室温过低时可以40℃水浴促进溶解);然后把试剂四倒入试剂二瓶中,混匀后室温保存。

粗酶液提取:

  1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心15min,取上清,置冰上待测。

  2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心15min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

γ-GT测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到405 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min(保证无沉淀)。

3. 测定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,依次加入20μL上清液,180μL工作液,混匀后于405nm测定10s和70s时吸光度,记为A1和A2。

γ-GT活性计算:

标准曲线:y=0.006x+0.0016,x为对硝基苯胺浓度,y为吸光值,R2=0.999。

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/g 鲜重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷V样÷T

= 1.67 × [ (A2-A1)-0.0016]

V反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4L;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);W :样品质量;V样:反应体系中加入上清液体积(mL),20μL=0.02 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),1min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y=0.003x+0.0016,x为对硝基苯胺浓度,y为吸光值,R2=0.999。

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=3.34× [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每克样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/g 鲜重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升液体每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷V样÷T

= 3.34 × [ (A2-A1)-0.0016]

V反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4L;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);W :样品质量,g;V样:反应体系中加入上清液体积(mL),20μL=0.02 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),1min。

注意事项:

培养细胞中γ-GT活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。

配置好的工作液2周内使用完毕。

上海牧荣生物科技有限公司

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