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丙酮酸羧化酶(PC)测试盒

简要描述:丙酮酸羧化酶(PC)测试盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,为客户提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-06
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详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

丙酮酸羧化酶(PC)测试盒

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中,催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,是糖异生过程的第一个限速酶,在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。

测定原理:

PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm下测定NADH氧化速率,即可反映PC活性。

需自备的仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体18 mL×1瓶, 4℃保存;

试剂二:液体13uL×1支,4℃保存;

试剂三:粉剂×1支,-20℃保存;

试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL提取液,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  2. 将匀浆600g,4℃离心5min。

  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

  4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的PC(此步可选做)。

  5. 在步骤④的沉淀中加入1mL提取液,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体PC活性测定。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四的配制:在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

  1. 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂四和180μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.5,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.5可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PC活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。



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丙酮酸羧化酶(PC)测试盒






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