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脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒

简要描述:脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒 脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)试剂盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

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  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
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详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒

微量法 100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

DHAR存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR催化GSH还原DHA生成AsA和GSSG,调控细胞AsA/DHA比值,是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性,可提高植物食品中AsA含量,进而提高植物食品的营养品质。

测定原理:

DHAR催化GSH还原DHA生成AsA,通过测定DHA减少速率,计算DHAR活性。

实验中所需仪器及设备:

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体17.5mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1瓶(棕色),4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取:

按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);8000g 4℃离心20min,取上清液置冰上混匀待测。

3.  血清等液体:直接测定。

DHAR测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到265nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL试剂三、20μL试剂四和140μL 试剂二,最后加20μL上清液迅速混匀后于265nm比色,记录30s和150s的吸光值A1和A2,△A=A2-A1。

DHAR活性计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

= 92×△A ÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样÷T

= 92×△A

ε :AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol /cm;106:摩尔分子换算成微摩尔分子;d:比色杯光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 L;V样:反应体系中加入上清液体积,20μL =0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;W :样品质量;T:反应时间,2 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

= 184×△A ÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样÷T

= 184×△A

ε :AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol /cm;106:摩尔分子换算成微摩尔分子;d:96孔板光径,0.5 cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 L;V样:反应体系中加入上清液体积,20μL =0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;W :样品质量;T:反应时间,2 min。

注意事项:

临用前配制的试剂未使用完的4℃保存,3天内使用完。


上海牧荣生物科技有限公司

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脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)测试盒




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