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顺乌头酸酶(ACO)测试盒

简要描述:顺乌头酸酶(ACO)测试盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
  • 访  问  量:55

详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

顺乌头酸酶(ACO)测试盒

微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

顺乌头酸酶(aconitase),三羧酸循环中的酶,催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化,在顺乌头酸酶作用下,通过脱水与加水反应,使羟基由β碳原子转移到α碳原子上,生成易于脱氢氧化的异柠檬酸,为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将NAD+ 还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:液体5mL×1瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加1.5mL蒸馏水充分溶解;现配现用

试剂七:粉剂×1支,4°保存;临用前加12mL试剂四充分溶解;

工作液:临用前在12mL试剂七中加入1mL蒸馏水、1mL试剂四、1mL试剂五、1mL试剂六充分混匀

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  2. 将匀浆转入离心管内600g,4℃离心5min。

  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

  4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定胞质顺乌头酸酶活性

  5. 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。

测定步骤

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

  2. 样本测定

(1)将工作液,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min;现配现用;若分次用将工作液分装后于-20°保存,一星期内可用。

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入40μL样本160μL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

ACO活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=268×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=54×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.108×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.04 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.96孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

 ACO(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=108×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.216×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.04 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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顺乌头酸酶(ACO)测试盒



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