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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒

简要描述:线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
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详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒

微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

MDH EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

测定原理:

MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四、液体20 mL×1瓶,在4℃保存;

试剂五、粉剂×1瓶,-20℃保存;

样本测定的准备:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  2. 将匀浆液于600g,4℃离心5min。

  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

  4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的MDH(此步可选做)。

  5. 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于MDHm活性测定。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、检测工作液的配制:用时在试剂五中加入19mL试剂四和0.5mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、测定前将检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本和195μL工作液,混匀后立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。




MDHm活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T =1299×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.65×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T =2598×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=1.3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000万。


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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒




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