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NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)活性测定试剂盒

简要描述:NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)活性测定试剂盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-04-26
  • 访  问  量:119

详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)活性测定试剂盒


注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员,催化氧化型P450还原再生。

测定原理:

NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素C,还原型细胞色素C在550nm处有特征吸收峰;通过测定550nm吸光度的增加速率,来计算NCR活性。

自备仪器和用品:

普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:粉剂×2瓶,4℃保存。临用前根据用量每瓶加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体×1瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1管,-20℃保存。临用前配制,加1.04 mL蒸馏水充分溶解,4℃保存。

试剂四:粉剂×1管,4℃保存。临用前配制,加1100 μL蒸馏水充分溶解,4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核和线粒体等:称约0.5g组织,加入4℃预冷的1 mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心30min,取上清液,转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体:4℃,100 000g,离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1 mL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL,盖紧后充分震荡溶解,4℃保存待测。

NADPH-细胞色素C还原酶测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到550 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二在37℃水浴中预热30min。

3. 空白管:取微量石英比色皿/96孔板,依次加入10μL蒸馏水、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四,迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化,第10s和第130s吸光值。△A空白管=A2-A1。

4. 测定管:取微量石英比色皿/96孔板,依次加入10μL提取液、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四,迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化,第10s和第130s吸光值。△A测定管=A4-A3。

注意:空白管只需做一次。

NCR活性计算公式公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T

= 550×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中,每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T

=275×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε:还原型细胞色素C摩尔消光系数,19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm;d:比色皿光径(cm),1cm;V反总:反应体系总体积(L),210μL=2.1×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),10μL=0.01mL;V样总:提取液体积,0.5 mL;T:反应时间(min),2min 。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)÷T

= 1100×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中,每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细胞色素c为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g 鲜重) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T

= 550×(△A测定管-△A空白管)÷W

ε:还原型细胞色素C摩尔消光系数,19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm;d:96孔板光径(cm),0.5cm;V反总:反应体系总体积(L),210μL=2.1×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),10μL=0.01mL;V样总:提取液体积,0.5mL;T:反应时间(min),2min 。

注意事项:

试剂三、试剂四临用前配制,配好未使用完的4℃可保存两天。


上海牧荣生物科技有限公司

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