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NADP-苹果酸酶(Malic enzyme,NADP-ME)试剂盒

简要描述:NADP-苹果酸酶(Malic enzyme,NADP-ME)试剂盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-04-26
  • 访  问  量:95

详细介绍

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应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

NADP-苹果酸酶(Malic enzyme,NADP-ME)试剂盒


正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中,尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应,产生丙酮酸和CO2,以及伴随NAD(P)+的还原反应,是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多,已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同,可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理:

NADP-ME催化NADP+还原成NADPH,在340nm下测定NADPH增加速率。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存。;

试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存; 临用前加入20mL试剂一充分振荡,溶解待用,用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入2.5mL蒸馏水充分振荡,溶解待用,用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融。

样本的前处理:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);14000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。14000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和170μL试剂二,混匀,30℃孵育5min,加入20μL试剂三,混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

NADP-ME活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 3215×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T =6.43×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T =12.86×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。


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