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二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)测试盒

简要描述:二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)测试盒 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

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  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-06
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详细介绍

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应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)测试盒 

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶,既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的大小直接影响着光合速率。

测定原理:

在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶I(NADH)氧化。因此,340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化速率,还原型辅酶I氧化速率可反应Rubisco的活性。

需自备的仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液一:液体100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:25mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入10mL试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入10mL试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入1 mL试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(注意:试剂二、三、四溶解后,按需分装-20℃保存。)

粗酶液制备

①总Rubisco提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体Rubisco酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一),冰浴匀浆后于4℃,200g离心5min,弃沉淀,取上清在4℃,8000g离心10min,取上清用于测定胞浆Rubisco酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定叶绿体中Rubisco酶活性。

建议测定总Rubisco酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco,则按照步骤②提取粗酶液。

(注意:粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

  2. 样本测定

  3. 工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三1:1混合,用多少配多少;

  4. 在微量石英比色皿或96孔板中加入10uL样本、10uL试剂四和180uL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

Rubisco活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义:25℃中1 g组织1 min氧化1nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义:

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5min;W:样本质量,g。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义:25℃中1 g组织1 min氧化1nmol NADH。

 Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义:

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;W:样本质量,g。



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二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)测试盒 




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