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转氢酶1测试盒

简要描述:转氢酶1测试盒 线粒体转氢酶-1(TH-1)试剂盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
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详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

转氢酶1测试盒

微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

TH位于线粒体的内膜上,又称为呼吸电子传递链复合体六,催化NADH+NADP+和 NAD++NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H+电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。

测定原理

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代NADP+,TH-1催化 APADP+还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收,因此通过测定375nm光吸收增加速率,来计算TH-1活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:液体100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体50mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体18mL×1瓶,4℃保存;

试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;

试剂五:粉剂×1支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  • 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  • 将匀浆600g,4℃离心5min。

  • 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。

  • 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-1(此步可选做)。

  • 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-1活性测定。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。

  2. 样本测定

(1)工作液的配制:临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

 

 

 

 

 

TH-1活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

 TH-1活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=74.5×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.149×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:APADPH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.96孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

 TH-1活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=149×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.298×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:APADPH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。


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