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线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒

简要描述:线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
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详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒

微量法 100管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理:

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:80mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:2 mL×1瓶,-20℃保存;

试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入2mL蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五:8mL×1瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入4mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂七:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂八:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂九:液体10mL×1 瓶,室温保存。

定磷剂的配制:按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  • 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  • 将匀浆600g,4℃离心5min。

  • 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

  • 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ(此步可选做)。

  • 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入800uL试剂二和8uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅴ酶活性测定。






测定步骤:

1、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)

试剂名称(μL)

对照管

测定管

试剂四

10

10

试剂五

40

40

样本


50

混匀, 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确水浴30min

试剂六

20

20

样本

50


混匀,4000g,25℃离心10min,取上清液

2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)

上清液

30

30

定磷试剂

170

170

混匀,室温静置10min后,在 660nm处读取A测定管和A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

复合体Ⅴ活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004;x为标准品浓度(mmol/L),y为A值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T

=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 L; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.808 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004;x为标准品浓度(mmol/L),y为A值。

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T

=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(W× V样÷V样总) ÷T

=101.5× (ΔA-0.004) ÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=0.203× (ΔA-0.004)

V反总:反应体系总体积,1.2×10-4 L; V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,0.808 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。


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线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒




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