详细介绍
品牌 | 其他品牌 | 供货周期 | 现货 |
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应用领域 | 医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药 |
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
ICDHm(EC 1.1.1.41)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,同时将NAD+ 还原为NADH,是三羧酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。
测定原理
ICDHm催化NAD+ 还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体20mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
将匀浆600g,4℃离心5min。
弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm(此步可选做)。
在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体ICDHm活性测定。
测定步骤
分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
样本测定
(1)在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在试剂六中加入1mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
ICDHm活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.65×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=650×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.3×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
上海牧荣生物科技有限公司
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