详细介绍
品牌 | 其他品牌 | 供货周期 | 现货 |
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应用领域 | 医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药 |
磷酸果糖激酶(PFK)测试盒
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。
测定原理
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;
试剂三:粉剂×1支,4℃保存;
试剂四:液体8μL×1支,4℃保存;
样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为1000~5000:1的比例(建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤
分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
样本测定
(1)在试剂二瓶中加入17mL试剂一和1.13mL蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2)在试剂三中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3)在试剂四中加入1mL蒸馏水充分混匀,冰上放置待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(4)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四和170μL试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 10min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之前请做1-2只预试,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
PFK活力单位的计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)PFK活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=321×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.1605×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)PFK活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=642×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=642×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.321×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。
上海牧荣生物科技有限公司
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