jenabioscience:生物素蛋白标记试剂盒——蛋白质生物素化试剂盒

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一组科学家于1998年成立，利用超过25年的学术知识为100多个国家的研究和行业客户开发创新试剂。

供一般实验室使用。

运输:凝胶包装运输

储存条件:储存在-20°C
避免冷冻/解冻循环

保质期:12个月

描述:
亲和素、链霉亲和素或NeutrAvidin与生物素的结合是已知*强的生物相互作用，解离常数在10范围内-15米（meter的缩写））
维生素生物素可以与许多蛋白质结合，而不会因生物素分子的小尺寸而丧失其生物活性。生物素化探针通常由抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或NeutrAvidin检测，携带报告基团，例如辣根过氧化物酶(HRP)或荧光标记。
感兴趣的蛋白质(POI)通常在不同的位置被生物素化。每个结合的生物素结合一个抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或NeutrAvidin分子，导致信号放大。
生物素和生物素结合蛋白之间的相互作用用于各种应用，如亲和层析、荧光激活细胞分选(FACS)、ELISA和蛋白质印迹。
该蛋白质生物素化试剂盒包含对5毫克POI进行5次单独标记反应所需的所有试剂。

内容:
生物素NHS-酯
5瓶，每瓶含1毫克

二甲基甲酰胺
500微升

碳酸氢钠
1瓶含168毫克

超纯水
2毫升

储存和稳定性:
收到后，将生物素储存在-20°c下。其他成分可储存在室温下。如果按照建议储存，Jena Bioscience保证该产品在12个月内保持最佳性能。

协议:
一般注意事项
蛋白质浓度应该至少为2 mg/ml，更高的浓度-高达10 mg/ml -是优选的，因为低浓度会影响标记效率。我们建议每个标记反应使用大约5毫克蛋白质。
含有伯胺如Tris和甘氨酸的缓冲液不适用于标记反应，必须在开始标记反应前用合适的不含胺的缓冲液如PBS、MES或HEPES替换。

实验协议

• 加入2 ml超纯水溶解碳酸氢钠。得到的1 M溶液在4°C下至少稳定2周。
• 向蛋白质溶液中加入适量的碳酸氢钠(1 M ),使最终浓度达到100 mM
• 从冰箱中取出一个生物素小瓶，并在打开前将其平衡至室温。通过添加100 μl DMF制备生物素，使浓度达到10 mg/ml。涡旋直至生物素*全溶解！在使用前准备好溶液！
• 将500 μl蛋白质溶液(10 mg/ml)和溶解的生物素加入适当的小瓶中。小心涡旋并短暂离心，收集试管底部的反应混合物。
• 室温下在摇床中培养一小时。
• 使用标准凝胶过滤柱如Sephadex G-25或类似物纯化缀合物。或者，游离生物素可以通过透析或适当的旋转浓缩器从缀合物中分离出来。

  
  请注意，该套件不提供蛋白质纯化材料！

• 用SDS-PAGE分析你的结合物。

结合物的储存
像未标记的蛋白质一样储存结合物。我们建议将溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷冻。避免反复冷冻和解冻！

故障排除:
低生物素化效率

• 蛋白质溶液的浓度

  
  

  该分析被优化用于标记浓度为10 mg/ml的5 mg蛋白质。

  
  

  生物素化的效率强烈依赖于浓度，并且在不同的蛋白质之间有所不同。因此，在每一种情况下，优化可能是获得最佳生物素化所必需的。
• 缓冲成分

  
  

  含有伯胺(甚至微量)的蛋白质溶液会显著降低生物素化效率。确保你的蛋白质被充分透析，以防它与含胺物质接触。
• pH值的影响

  
  

  检查你的蛋白质溶液的pH值！参考范围是8.2 - 8.5。

  
  

  蛋白质的伯氨基不能被质子化而具有活性，因此，蛋白质溶液的pH值必须足够高。另一方面，NHS酯的水解速率随着溶液pH值的增加而增加，从而产生非反应性生物素。最佳生物素化结果已在pH 8.3获得。

  
  

  在pH值较低的强缓冲蛋白质溶液中，100 mM碳酸氢钠可能不足以将pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氢钠，直到达到最佳pH值。

请注意，生物素化效率不仅取决于环境条件，还取决于蛋白质特性。蛋白质表面的三级结构和由此产生的赖氨酸数量以及等电点和蛋白质在pH 8.3下的行为起作用。

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