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| 品牌 | 其他品牌 | 货号 | M3029 |
|---|---|---|---|
| 供货周期 | 现货 | 应用领域 | 化工,生物产业,制药/生物制药 |
轻松跟踪移液步骤
稳健的性能 – 高度稳定的 PCR 预混液
菌落筛选 – 针对快速筛选进行了优化
无需额外步骤 – 已包含上样缓冲液
方便的规格 – 1.5 mL 等分试样大小，易于作
含红色染料的 PCR MasterMix，用于移液步骤的视觉控制：PCR 后，无需添加电荷缓冲液即可进行电泳。这使得该 PCR 预混液 （2x） 节省了时间和成本。含红色染料的 PCR RedMasterMix （2x） 还具有高度特异性的特点，可获得最佳结果。
PCR MasterMix （2x） 是以下成分的优化（即用型）混合物：
- Taq DNA 聚合酶
- dNTP
- MgCl2
- 红色染料
- 反应缓冲液
用于使用 PCR 高效扩增 DNA 模板。您所要做的就是添加引物和模板 DNA。同时，PCR 预混液含有添加剂和红色染料，这使得无需添加电荷缓冲液即可进行后续电泳。该 PCR RedMastermix 专为扩增子长度达 4 kb 的常规 PCR 而开发。缓冲液的特殊成分保证了即使在反复解冻和冷冻循环后也能获得可重复的结果。
含 Red 染料的 PCR 预混液以 1.25 mL 的方便等分试样运输。
我们的 RedMastermix 也可用于 Sanger 测序。为此，请在 PCR 后以 1：8 的比例稀释 PCR 混合物，或用离心柱纯化，然后应用。
规格：
用于 PCR 的 2 次即用型预混液，包括用于更好地观察移液的红色染料和凝胶上样染料。已包括 dNTP、缓冲液和 DNA 聚合酶。
方便的等分试样大小：1.25 mL。该预混液在 +2°C 至 +8°C 下可稳定保存至少 8 个月。
用于小鼠尾巴的可靠 PCR。用于 Sanger 测序反应。
One unit is defined as the amount of enzyme which will convert 10 nmoles of dNTPs to an acid-insoluble form in 30 min at 72°C under the assay conditions (25 mM TAPS (tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propanesulfonic acid, sodium salt) pH 9.3 (25°C); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1 mM b-mercaptoethanol; and activated calf thymus DNA as substrate.
synthetic
eclass-Nr: 32-16-05-02
技巧
对于每个模板/引物对，必须凭经验评估最佳反应条件，例如通过改变引物与模板的比例或离子强度（使用 MgSO4）和循环参数（时间和温度）。
DNA 模板
GENAXXON Red 预混液特别适用于不太干净的鼠尾 DNA
关于 10E4需要靶 DNA 的拷贝才能在 25-30 个循环后获得可检测的产物。
使用 1pg–1ng 质粒 DNA 或病毒 DNA。
使用 1ng–1 μg 用于基因组 DNA。
较高的 DNA 浓度会降低扩增子特异性，并导致额外的条带，尤其是当使用大量循环时。
如果需要较少的循环次数，例如为了提高特异性，可以使用更高的 DNA 浓度。
底漆
一般来说，这些应该有 20-30 个核苷酸的长度。
理想的 GC 含量为 40-60%。
GC 碱基应尽可能均匀地分布在引物上。
引物对的两种引物的熔解温度相差不应超过 5°C。
避免引物内的二级结构（例如发夹）以及所用引物对之间潜在的二聚化区域。
如果将转基因位点（侧面定向诱变）掺入引物中，那么最好在距离侧面定向诱变位点 5' 处插入 4-6 个额外的碱基，以便引物可以在正确的位置退火。
每种引物的最终浓度应在 0.05-1 μM 之间（0.05 μM 是下限），典型值在 0.1 至 0.5 μM 之间。
较高的浓度会导致引物二聚化增加，并“产生"或模拟假扩增产物。
在引物和探针的情况下，可以假设随着引物量的增加，PCR 一开始当然也会运行得更好（通常一开始会预期 Ct 值会更早）。然而，随着浓度的持续增加，PCR 达到饱和。除了略低的 Ct 值外，荧光信号通常也在开始时以较高的引物/探针浓度被放大。
此外，可以添加一个或多个探针（应始终充分测试必要的浓度）。我们建议在 50-500 nM 之间。在这方面，应测试不同的组合。
镁浓度
1.5-2.0 mM Mg2 + 是 Taq DNA 聚合酶作用的选择，但最佳 Mg2 + 浓度在很大程度上取决于模板、缓冲液组成、DNA 量以及 dNTP，因为后两者尤其具有螯合镁的高倾向，从而将其从 PCR 反应中吸收。
如果 [Mg2+] 太低：不可见 PCR 产物。
如果 [Mg2+] 过高：可以看到不需要/不正确的 PCR 产物。可能只能看到涂片。
脱氧核苷酸 （dNTPs >）
典型浓度为 200 μM 每个单独的 dNTP。然而，原则上，200-400 μM 的 dNTP 是 PCR 的良好浓度。
50-100 μM 的较低浓度会增加特异性，但在某些情况下会显著降低产量。
较高的浓度会增加产量，尤其是对于长扩增子，但会显著降低特异性。
DNA 聚合酶
选择正确的聚合酶取决于预期用途和所使用的模板（标准 PCR：高准确度的 Taq DNA 聚合酶 S >，高产量的 Taq 聚合酶 E >;预混液：标准 PCR MasterMix > 或 Red MasterMix >含红色染料）。
对于多重 PCR，有特殊的冻干多重 MasterMixe >。
为了提高特异性或对于困难的模板，建议使用热启动应用程序。为此，>有特殊的热启动聚合酶。
对于用于克隆或其他需要低错误率的方法的 PCR，热稳定的高保真校正聚合酶，如
Pfunds >、ExactRun >、ReproFast > 或 ReproHot （KOD） 校正聚合酶>。这些酶在扩增过程中的错误要少得多，并增加了无错误扩增子的机会。
对于基因分型和其他需要高鉴别度的应用，有一种新型高选择性 DNA 聚合酶 SNP Pol DNA 聚合酶 >。它特异性地区分错配的引物模板复合物，并特异性地仅提供具有*全匹配引物对的 PCR 产物。
对于实时定量 PCR >，有高度专业化的 qPCR 预混液。在这里，选择合适的预混液取决于所使用的 qPCR 设备。例如，重要的是要注意 qPCR 预混液中是否应包含 ROX 以及应包含多少 ROX，以及它是带有绿色荧光染料>的 Green qPCR Mastermix 还是不含荧光染料的 Probe qPCR MasterMix >。也可提供在室温下稳定的微珠冻干 （LyoBalls >）。
PCR 反应中使用的 DNA 聚合酶量会显著影响 PCR 结果（对于 50 μL 方法，使用 1.25 - 1.5 单位 Taq 聚合酶>）。
退火
退火温度应通过温度梯度进行优化。退火期也会影响成功。确实，使用不同的预混液或使用其他供应商的反应缓冲液会对退火温度产生严重影响。
引物对的两种引物的熔解温度相差不应超过 5°C。
典型的退火温度比所用引物的*低 Tm 低约 5°C。温度通常下降到 50-60°C 之间。
如果存在非特异性条带或润滑，则应测试更高的退火温度。
典型的退火时间在 15-30 秒范围内。
延伸温度和时间
扩增子延伸通常在 68°C 下进行。
作为一般规则，可以假设每 1000 个碱基对的标准 Taq 聚合酶在 68°C 下的延伸时间为 1 分钟（或 2000 个碱基对为 2 分钟，或 3000 个碱基对为 3 分钟）。
对于小于 1 kb 的 PCR 产物，可以采取 45-60 秒（如果不是接近 1 kb 的扩增子，则更像是 45 秒）。
超过 3000 个碱基对的 PCR 产物和超过 30 个循环的 PCR 方案都可能需要更长的延伸时间。因此，应再次优化更长的扩增子或更高的循环数。
扩增具有高 GC 含量、强二级结构、低浓度或大于 5 kb 的扩增子的模板通常需要优化 PCR 条件。通常，在 PCR 过程中应在 95°C 下进行 15-30 秒的变性。
上海牧荣生物科技有限公司 是一家专注于分子生物学、细胞生物学、细菌学、遗传学、免疫学、生物化学、蛋白质学、细胞治疗、临床应用等领域，以销售为主的生物技术公司。销售的产品涉及，细胞株和菌株、胎牛血清、生化试剂、ELISA试剂盒、抗体和抗原、细胞因子、技术服务、实验耗材和消耗品、仪器设备等。客户遍布大学、研究所、医院、卫生防疫、商品检验检疫、制药公司、生物技术公司和食品工业等单位。
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