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谷胱甘肽还原酶(GR)测试盒

简要描述:谷胱甘肽还原酶(GR)测试盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
  • 访  问  量:42

详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

谷胱甘肽还原酶(GR)测试盒

微量法 100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中GR被TrxR取代)。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH,有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外GR还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。

测定原理:

GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH,同时NADPH脱氢生成NADP+;NADPH在340 nm有特征吸收峰,相反NADP+在该波长无吸收峰;通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率,从而计算GR活性。

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水

试剂组成和配置:

试剂一:液体120mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×2支,-20℃保存。临用前加入1.2mL蒸馏水,混匀。

试剂三:粉剂×2支,-20℃保存。临用前加入0.6mL蒸馏水,混匀。

粗酶液提取:

  1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心15min,取上清,置冰上待测。

 

  1. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心15min,取上清置于冰上待测。

 

  1. 血清等液体:直接测定。

操作步骤:

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂一置于25℃(普通物质)或者37℃(哺乳动物)中预热30min。

3. 测定管:取微量石英比色皿或96孔板,依次加入10μL试剂三,20μL试剂二,150μL试剂一,20μL上清液,混匀,于340nm迅速测定初始吸光度和180 s吸光度,记为A测1和A测2,△A测定管= A测1﹣A测2。

(注意:

  1. 加完上清液后必须迅速混匀测定,保证准确测出初始反应速度;

  2. 当出现初始180s内吸光值不稳定时,可以适当延长反应时间,选取相对稳定的时间段内吸光值变化值;

3.当所测△A测定管的值在零点附近徘徊时,可能原因:(1)样本GR酶活性低,建议浓缩样本后再进行测定;(2)样本GR酶活性过高,吸光值变化区间过小无法准确测出,建议样本稀释2~5倍后再进行测定)

 

计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷[Cpr×V样]÷T

= 536×△A测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每克样本每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109] ÷(W×V样÷V样总)÷T

= 536×△A测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109] ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T            

= 536×△A测定管÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷×V样÷T

= 536×△A测定管

ε:NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;106:1 mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL =2×10-2 mL;V样总:提取液体积,1 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间,3 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷[Cpr×V样]÷T

= 1072×△A测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每克样本每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109] ÷(W×V样÷V样总)÷T

= 1072×△A测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A测定管÷ε÷d×V反总×109] ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T            

=1072×△A测定管÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×109]÷×V样÷T

=1072×△A测定管

ε:NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5 cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;106:1 mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL =2×10-2 mL;V样总:提取液体积,1 mL;V样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间,3 min。

注意事项:

(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;

(2)试剂二和试剂三须现配现用,配制完后,置于冰上,未使用完的4℃保存,三天内使用完。

(3)测定前须先用12个样做预实验,哺乳动物组织一般须用试剂一稀释25倍。

(4)细胞中GR活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。


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谷胱甘肽还原酶(GR)测试盒

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