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辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

简要描述:辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒 上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-08
  • 访  问  量:58

详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

微量法 100管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP(NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH,从而检测NADP+含量。

所需的仪器和用品

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

碱性提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体10 mL×1瓶,4℃保存; 

试剂二:粉剂×1支,-20 ℃保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀;溶解后4 ℃保存一周;

试剂三:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂四:粉剂×1支,4 ℃保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂五:液体3.6mL×1支,4 ℃保存;

试剂六:液体30mL×1瓶,4 ℃保存;

试剂七:液体50mL×1瓶,4 ℃保存。

NADP+NADPH的提取

血清(浆)中NADP+NADPH的提取

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADPH的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL碱性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2组织中NADP+和NADPH的提取

NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADPH的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3 细胞或细菌中NADP+和NADPH的提取

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADPH的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

  1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。

  2. 加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样):

试剂名称(μL)

对照管

测定管

样本

20

20

试剂一

80

80

试剂二

30

30

试剂三

30

30

试剂四

30

30

试剂五

30

30

试剂六

200

混匀,室温避光静置20min

试剂六


200

充分混匀,静置5min后,20000g,25℃离心5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

400

400

混匀,取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2,计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若NADP+测定中△A(A2-A1)≤0.0144,NADPH测定中△A(A2-A1)≤0.0259,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间20min延长到60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒100管保证测48个NADP+或NADPH.
NADP+和NADPH含量的计算

(一)NADP+含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.0985x + 0.0144,R2 = 0.9998;其中y为△A,x为NADP+浓度nmol/mL

1、血清(浆)中NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144)

2、组织、细菌或细胞中NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP+ (nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144)÷W

 (3)按细菌或细胞密度计算

NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A -0.0144)÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144)

 

(二)NADPH含量的计算

标准条件下的回归曲线为y = 0.6198x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中y为△A,x为NADPH浓度nmol/mL

1、血清(浆)中NADPH含量计算

NADPH含量(nmol/mL)= [(△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259)

2、组织、细菌或细胞中NADPH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot)=[ (△A -0.0259)÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/104 cell)=[(△A -0.0259)÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259)V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

注意:*低检测限为0.01nmol/mL或0.01nmol/g鲜重 或0.001nmol/mg prot


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辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

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