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碱性蛋白酶测试盒

简要描述:碱性蛋白酶测试盒 碱性蛋白酶(Alkaline protease, AKP)活性测定试剂盒上海牧荣生物科技有限公司专业实验室产品.为客户全面解决实验、生产、开发需求,提供方便、快捷的服务。

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2024-05-09
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详细介绍

品牌其他品牌供货周期现货
应用领域医疗卫生,化工,生物产业,农业,制药

碱性蛋白酶测试盒

微量法 100T/48S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类,属于丝氨酸蛋白酶。此外,该酶还能够水解酯键、酰胺键,具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一,广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。

测定原理:

在碱性条件下,AKP水解酪蛋白生成酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝;钨蓝在680nm有特征吸收峰,测定680nm吸光度增加速率,来计算AKP活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、0.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加5mL蒸馏水溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热15-30分钟,该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。

试剂四:粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加20mL蒸馏水溶解。

试剂五:液体5mL×1瓶,4℃保存。

标准品:液体1mL×1支,0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。

血清或培养液:直接测定。

细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到680 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于40℃水浴保温30min。

3. 对照管:取0.5 mL EP管,加入20 μL粗酶液,40 μL试剂二,混匀后置于40℃水浴保温10min;加入40μL试剂三,混匀后8000g ,4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于40℃水浴保温20min,吸取200μL于680nm测定光吸收,记为A对照管。

4. 测定管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂三,混匀后置于40℃水浴保温10min;加入40μL试剂二,混匀后8000g,4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于40℃水浴保温20min,吸取200μL于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)

5. 空白管:取0.5 mL EP管,加入40μL蒸馏水,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于40℃水浴保温20min,吸取200μL于680nm测定光吸收,记为A空白管。

6. 标准管:取0.5 mL EP管,加入40μL标准品,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于40℃水浴保温20min,吸取200μL于680nm测定光吸收,记为A标准管。

注意:空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式:

1. 按照样本蛋白浓度计算

AKP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

AKP活性(nmol/min /mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

AKP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。

AKP活性(nmol/min /g鲜重)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

3. 按照液体体积计算

AKP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

AKP活性(nmol/min/mL)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷V1÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

按照细胞数量计算

AKP活性单位定义:30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

AKP活性(nmol/min /104 cell)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷细胞数量

C标准品:0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液;V反总:酶促反应总体积,0.1mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),0.02 mL;V2:提取液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min;W:样品质量(g)。

注意事项:

临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。


上海牧荣生物科技有限公司

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碱性蛋白酶测试盒




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